耳鼻喉科前沿BRAF抑制剂Dabra

供稿单位：复旦大医院

供稿：刘畅

审稿：陈岩副研究员，李华伟教授

尽管科学家们对感音性耳聋的治病机制进行了广泛研究，但迄今为止，已经被食品药物管理局（FDA）批准可用于治疗听力损失的药物非常少。蛋白激酶可调节关键的细胞功能，许多激酶抑制剂已被FDA批准用于人类疾病治疗。

年，克瑞顿大学的MatthewAIngersoll教授团队在ScienceAdvances杂志发表了题目为“BRAFinhibitionprotectsagainsthearinglossinmice”的文章，报道BRAF激酶小分子抑制剂Dabrafenib及其它6个BRAF/MEK/ERK通路的抑制剂能够减轻顺铂诱导的毛细胞损失。

Dabrafenib能够透过血迷路屏障，是FDA批准用于临床治疗癌症的口服药物，可用于治疗BRAF活化的多种癌症，如黑色素瘤、小细胞肺癌、甲状腺和胆道癌。

此团队采用成年小鼠耳聋模型，进一步证实Dabrafenib能够预防和减轻顺铂或噪声诱导的听力损失。当Dabrafenib和AZD(年报道的听觉保护药物)联用时，噪声所致耳聋小鼠的听力完全恢复。

这一发现将促进Dabrafenib应用于听觉临床研究，造福耳聋病人。

团队首先使用了HEI-OC1细胞系和顺铂损伤模型对种小分子激酶特异性抑制剂进行无偏筛选。采用Caspase-3/7活性测定法检测细胞凋亡，结合细胞活性试验确定化合物对HEI-OC1细胞是否有保护作用。

在被测试的化合物中，对细胞保护作用最好的药物包括4个BRAF特异性抑制剂。BRAF是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RAF家族的成员，在Ras/RAF/MEK信号转导通路中发挥着重要的作用，并参与调节细胞增殖和细胞存活。

从胚胎18.5天(E18.5)开始，BRAF便可在小鼠内耳(HCs和SCs)中检测到。前人研究报道：在噪声损伤后，小鼠内耳中磷酸化ERK的表达上调，并触发细胞凋亡信号通路。

因为Dabrafenib已经被FDA批准用于人类癌症的治疗，并且是口服生物利用型，因此团队选择Dabrafenib继续研究其毛细胞保护作用。

图1团队通过无偏筛选发现BRAF特异性抑制剂

具有潜在的毛细胞保护作用

在MAPK级联通路中，BRAF直接磷酸化并激活MEK，而MEK可磷酸化并激活ERK。

团队采用小鼠耳蜗外植体培养方法和顺铂损伤毛细胞模型，证实4种BRAF抑制剂（Dabrafenib、Vemurafenib、PLX-和RAF-）、2种MEK抑制剂（Trametinib和Mirdametinib）以及ERK抑制剂AZD对顺铂所致毛细胞毒性有显著的抑制作用。

并且，Dabrafenib和Trametinib的联合使用可进一步抑制顺铂诱导的毛细胞毒性。Westernblot检测结果显示：顺铂处理后，随着时间的增加，BRAF、MEK和ERK的磷酸化显著增加；给予Dabrafenib处理后，BRAF、MEK和ERK的磷酸化显著降低。

研究人员通过耳蜗外植体免疫荧光染色进一步明确了此结论:耳蜗外植体经顺铂处理不同时间后，磷酸化ERK增加，Dabrafenib预处理可逆转顺铂诱导的ERK通路激活。这些实验结果说明Dabrafenib确实抑制了BRAF/MEK/ERK通路激活从而发挥毛细胞保护作用。

图2Dabrafenib抑制了BRAF/MEK/ERK通路激活

团队进一步采用成年小鼠耳聋模型研究Dabrafenib是否具有听觉保护作用。

结果显示：提前给予Dabrafenib(mg/kg/d)不仅能够预防顺铂导致的听力损失，也能够预防噪声诱导的毛细胞丢失和听力损失。同样，Dabrafenib对顺铂诱导的斑马鱼神经丘毛细胞丢失也具有抑制作用。

图3Dabrafenib能够预防和减轻顺铂或噪声诱导的听力损失

那么Dabrafenib在发挥听力保护作用时，是否会降低顺铂的肿瘤杀伤效果呢？

研究结果证实，Dabrafenib没有降低顺铂杀伤肿瘤细胞的作用。事实上，在IMR-32和SHP-77肿瘤细胞系中，Dabrafenib增强了顺铂杀伤肿瘤细胞的作用。

图4Dabrafenib增强顺铂杀伤肿瘤细胞的作用

最后，团队研究了Dabrafenib是否能用于噪声性耳聋的治疗，先用噪声导致小鼠耳聋，再给予药物研究其听力挽救作用。

研究结果显示，单独用Dabrafenib或AZD(CDK2抑制剂)都有一定的听力保护作用，但不能达到完全的听力恢复。而当联合应用Dabrafenib和AZD时，小鼠听力几乎完全恢复，达到了非常理想的治疗效果。

图5Dabrafenib能用于噪声性耳聋的治疗

该文章的研究结果显示：

BRAF/MEK/ERK通路不但在肿瘤细胞中起关键作用，而且在有丝分裂后的耳蜗毛细胞中发挥促凋亡和应激激活的作用。BRAF抑制剂Dabrafenib可用于防治顺铂或噪声所致的听力损失，有望成为FDA批准的首批用于听力保护的药物之一。

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